Teknik
Pewarnaan Bakter
1. Mengamati Morfologi Bakteri
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan
perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa
pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas
sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna
dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan
sekelilingnya ditingkatkan.
Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian
yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan
positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat
warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena
muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna
asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin,
Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll.
2. Jenis Pewarnaan
Pewarnaan pada bakteri di bagi menjadi tiga, yaitu :
2.1 Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.
Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai
organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka
dan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya
bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan
rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan
sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin. yang man
pewarnaan sederhan ini di bagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan
a. Pewarnaan Asam
Mewrupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan untuk
hanya untuk melihat bentuk sel. adapun zat warna yang di pakai dalam pewarnaan
positif adalah biru metilen, dan air furksin.
Cara kerja untuk melakukan pewarnaan bakteri yaitu sebelum dilakukan pewarnaan
dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan
menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri
terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan
mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri
pada object glass tanpa merusak struktur selnya.
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri
tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini
mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk
menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami
pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya
penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat
diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta
cina.
Cara kerja pewarnaan negatif, yaitu ambil dua object glass, teteskan nigrosin
atau tinta cina di ujung kanan salah satu object glass. biakan diambil lalu
diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi, lalu dicampurkan
Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri Biarkan
preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api.
.2 Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan
gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram
(1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan
antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif
adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode
pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu
gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada
uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah
metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau
merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri
ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi
atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan
bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan
bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna
ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna
(decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi
dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak
akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna
dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila
warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada
hasil akhir tetap warna dasar. Jadi bahan zat warna yang di pakai dalam
pewarnaan gram, yaitu kristal violet, larutan iodin, alkohol 90 %, dan larutan
safranin. Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk
membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat
dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
a. Bakteri Gram negatif
Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna
ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak.
Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan
setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna
merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua
tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka
berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan
komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan
lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).b.Bakteri Gram Positif
Bakteri gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu
proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah
mikroskop, sedangkan bakteri gram-negatif akan berwarna merah atau merah muda.
Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel bakteri.Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu
Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau
monolayer. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%),
peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih
dari 50% berat ringan.
Cara kerja pewarnaan diferensial, yaitu Sediakan kaca benda yang bersih, lalu
lewatkan diatas nyala api bunsen teteskan setetes aquades steril diatas kaca
benda tersebut secara aseptik ambilah inokulum bakteri yang akan diperksa, lalu
letakkan diatas tetesan aquades itu, kemudian ratakan perlahan-lahan ambil kaca
benda yang tegak sehingga apusan menjadi tipis dan merata. Biarkan sampai
kering fiksasi dengan cara melewatkan apusan tersebut diatas nyala api dengan
cepat letakkan apusan diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk
pewarna. Lalu teteskan larutan kristal violet pada apusan dan biarkan selama
30-60 detik cuci warna dasar dengan air mengalir, keringkan teteskan larutan
iodin pada apusan, biarkan selama 30-60 detik cuci larutan iodin dengan air
mengalir, keringkan rendam atau basuh dengan alkohol ... % selama ... detik
teteskan larutan safranin, biarkan selama 30-60 detik cuci dengan air mengalir,
lalu keringkan amati dengan mikroskop gambar bentuk morfologi